A Nagasaki, in epoca presente. In una casa in collina il tenente della marina americana, Pinkerton, attende il corteo nuziale della sua sposa, la geisha Cio-cio-san. Durante l’attesa Goro, sensale di matrimoni, gli mostra la casa, magnificandone gli accessori, poi gli presenta i servitori e Suzuki, cameriera di Cio-cio-san. Giunge il console americano Sharpless (duetto "Ah!... quei ciottoli m’hanno sfiaccato!"); Pinkerton gli rivela la sua morale libertina e cinica ("Dovunque al mondo lo Yankee vagabondo") e infine non tralascia di descrivere i pregi della futura consorte ("Amore o grillo"), dichiarando di volerla sposare secondo la legge giapponese, con il diritto di ripudiarla anche dopo un mese. Intanto la giovane donna, ignara e innamorata, esprime la sua gioia alle amiche (voce di Butterfly: "Spira sul mar") e, appena entrata in scena, presenta i parenti al futuro marito. Terminata la cerimonia nuziale, irrompe lo zio bonzo, maledicendo la nipote per aver rinnegato la religione degli avi (aria di Butterfly: "Ieri son salita tutta sola in secreto alla Missione"); Pinkerton lo scaccia e rimane finalmente solo con Butterfly (duetto "Viene la sera... Bimba dagli occhi pieni di malia").

In una stanza della casa Butterfly discorre con Suzuki: Pinkerton è partito, promettendo di tornare in primavera, ma da tre anni non dà notizie di sé. Nonostante i dubbi dell’ancella, Butterfly, forte di un amore ardente e tenace, è convinta di non essere stata abbandonata dal proprio marito e fiduciosa l’attende ("Un bel dì vedremo"). Sharpless giunge con Goro, con lo scopo di leggerle la lettera in cui si annuncia l’arrivo del tenente e il suo nuovo matrimonio con un’americana (duetto "Chiedo scusa..."), ma dopo inutili tentativi non osa riferire tale messaggio. Intanto Goro propone a Butterfly nuovi facoltosi pretendenti, dal momento che, per la legge giapponese, la donna abbandonata è considerata di nuovo libera, ma perfino il nobile e ricco Yamadori viene respinto: ella dichiara ostinatamente di ritenersi sempre maritata. Quando Sharpless tenta di prepararla alla notizia dell’abbandono, Butterfly gli mostra il figlio di cui Pinkerton ignora l’esistenza ("Che tua madre"). Intanto al porto sta approdando una nave americana, ed è proprio quella di Pinkerton; Butterfly la identifica col cannocchiale e, commossa, corre felice sul terrazzo seguita dalla sua ancella ("Scuoti quella fronda di ciliegio"), adorna la casa di fiori (valzer dei fiori: "Gettiamo a mani piene"), indossa per la particolare occasione le vesti nuziali e veglia tutta la notte in attesa dell’amato (coro a bocca chiusa).

È l’alba (preludio orchestrale, coro di marinai). Butterfly, dopo aver aspettato inutilmente, si allontana dalla stanza col bimbo addormentato e sale a riposare. Poco dopo Pinkerton, accompagnato da una giovane donna, Kate, da lui sposata negli Stati Uniti, giunge con l’intento di prendersi il bambino - della cui esistenza è stato messo al corrente dal console Sharpless -, portarlo in patria ed educarlo secondo gli usi occidentali. Egli contempla la casa con grande rimpianto ("Addio, fiorito asil") e preso dal rimorso si allontana, proprio nel momento in cui Cio-cio-san fa il suo ingresso con il figlio. Sharplesse le consiglia di affidare il bambino ai Pinkerton ("Io so che alle sue pene") ed ella a malincuore acconsente; tuttavia, ormai privata di tutti gli affetti più cari, decide di togliersi la vita. In silenzio, senza clamori, dopo aver abbracciato disperatamente il figlio ("Tu, tu, piccolo Iddio"), si uccide con un pugnale; quando Pinkerton entrerà nella casa di Butterfly per chiedere il suo perdono, sarà ormai troppo tardi.